2018-5-17 星期四

問題解答

   常規問題: 


  問:雙光子顯微鏡實驗室的職責是什么?

  答:雙光子顯微鏡實驗室是為神經所各個課題組提供高級光學技術支持的公共實驗室,其功能是為實驗者提供光學顯微鏡實驗服務。我們的職責是:

  1. 掌握熒光顯微鏡領域最新的技術。

  2. 維持設備的正常運行。

  3. 培訓新的學員正確使用儀器。

  4. 協助有經驗的實驗者使用設備的更先進功能。

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  問:雙光子顯微鏡實驗室具有哪些儀器?

  答:

  1. 蔡司 LSM510 Axiovert 200M 倒置單光子激光掃描共聚焦顯微鏡

  蔡司 LSM510 Axiovert 200M 倒置單光子激光掃描共聚焦顯微鏡配有三個激光器:氬離子藍光激光器( 458 / 477 / 488 / 514nm , 30mW ),氦-氖綠光激光器( 543nm , 1mW ),氦-氖紅光激光器( 633nm , 5mW )。單光子顯微鏡具有四個PMT,其中三個用于熒光信號采集,一個用于透射光信號采集。

    配備可選的物鏡:

      Plan-NeoFluar 5X/0.15, D=0.17 mm, Ph1, WD=13.6 mm

      Plan-NeoFluar 10X/0.30, D=0.17 mm, DICI, WD=5.6 mm;

      Plan-NeoFluar 20X/0.50, D=0.17 mm, DICII, WD=2.0 mm;

      Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.2 mm;

      Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, Ph3, WD=0.2 mm

      Plan-Apochromat 63X/1.4 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.19 mm

      Alpha Plan-Fluar 100X/1.45 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.11 mm

      C-Apochromat 63X/1.20 W CORR, D=0.14 to 0.18 mm, DICIII, WD=0.24 mm;

  2. 蔡司 LSM510 Axioskop 2FS 雙光子正置激光掃描共聚焦顯微鏡

  蔡司雙光子正置激光掃描共聚焦顯微鏡配有三個可見光激光器和一個紅外雙光子激光器: 氬離子藍光激光器(458/477/488/514nm, 30mW),氦-氖綠光激光器(543nm, 1mW), 氦-氖紅光激光器(633nm, 5mW),Mira-900 雙光子激光器(700 – 980 nm, 500 mW)。 其中 Mira 900 雙光子激光器包括一個 Verdi-V5 二極泵源固體激光器和一個 Mira-900-F 鈦:蘭寶石鎖模激光器(配備一套Mira-F-V5-XW-110濾片)。Verdi-V5 是一個高能量二極泵源固體激光器,在 532nm 波段能產生高達5W 的持續能量。 Mira-900 是一個再生式鈦:蘭寶石鎖模激光器,可產生波寬為 100飛秒的脈沖激光。這兩個設備的聯合可以產生 700-980nm 波長可調的紅外脈沖激光束,用于雙光子激發實驗。 這套系統還裝備了兩個熒光通道的檢測器(光電倍增管),一個 META 檢測器,一個 NDD 檢測器,一個透射光檢測器。

    配備可選的物鏡:

      Plan-Neofluar 10x/0.30, DICI

      Plan-Neofluar 40xOil/1.3 DICIII

      Plan-APO 20x/0.75 DICII

      Plan-APO 20x/0.60 Ph2

      Plan-APO 100xOil/1.4 DICIII

      Achroplan 10X/0.30 W Ph1, WD=3.1 mm;

      Achroplan 20X/0.50 W Ph2, WD=1.97 mm;

      Achroplan 40X/0.80 W IR DICIII, WD=3.61 mm;

      Achroplan 63X/0.90 W IR DICIII, WD=2.0 mm;

  3.電生理實驗設備

  單光子共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡上還配置了若干用于電生理實驗的設備,包括:EPC-10 膜片鉗放大器,八通道程控脈沖發生器(A.M.P.I. 公司), 光隔離的 ISO-Flex 刺激隔離器(A.M.P.I. 公司), MP-285R 電動顯微操縱器(Sutter公司),紅外 CCD(C2400-79H ,Hamamatsu 公司)和控制部件(C2400-60,Hamamatsu公司),JVC 單色視頻監視器(TM-H140PN ,JVC)。

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  問:哪些人能使用雙光子顯微鏡實驗室的儀器?

  答:我們主要對中科院神經所和上海生命科學院的教員、博士后、研究生、職工開放。也對附近大學與生物技術公司的人員實行限時開放。

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  問:我該怎么預約實驗時間?

  答:你可以和我們的工作人員聯系預約實驗。地點在中科院神經所 419 房間,電話是 021-54921820。

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  問:我如何取消自己的預約?

  答: 必須提前一天取消所預約的實驗 ,請致電 021-54921820 取消實驗。

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  問:我該如何參加培訓課?

  答:由于儀器設備的復雜性,我們所有的培訓都采用一對一的方式。需要參加培訓的實驗者請與神經所大樓 419 號房間的胡謙老師聯系,或者電話預約(021-54921820)。我們建議實驗者首先建立一個針對自己實驗標本的有效的染色方法,在此基礎上請自帶一個熒光標記標本參加培訓。

  問:培訓課上,我應該帶些什么?

  答:需要帶一個熒光標記完好的標本。這意味著在培訓課之前,你必須建立好你的染色方法和預先觀察你的標本。請確認標本的信號足夠強(很容易看到)、背景足夠黑。我們的共聚焦顯微鏡系統是建立在蔡司的倒置顯微鏡和正置顯微鏡上,所以標本必須是如下:

  • 標本在載玻片上固定好并且必須用蓋玻片封片。而且,蓋玻片的型號只能用 1 號或者 1.5 號。
  • 使用單層蓋玻片封底的槽或者培養皿。

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  激光掃描共聚焦顯微鏡實驗方法 


  問:什么是激光掃描共聚焦顯微鏡實驗方法?

  答:在傳統的熒光顯微鏡中,一定波長的激發光被分光鏡反射、通過物鏡照亮標本,標本發出的熒光通過物鏡被分光鏡反射至目鏡,被眼睛看到。 使用傳統的熒光顯微鏡觀察厚標本的主要問題是:側向干擾(同一平面發出的熒光)和軸向干擾(不同平面發出的熒光)。

  激光掃描共聚焦顯微鏡通過兩種方式分別排除了傳統熒光顯微鏡觀察厚標本時發生的側向干擾和軸向干擾:1)用一個聚焦的光束點掃描標本,由于單一時間標本上只有一個點被激發光照射,因此排除了側向干擾; 2)在光檢測器前設置一個可以改變大小的針孔,使標本焦平面以外的發射光不能到達檢測器,因此排除了軸向干擾。


  問:激光共聚焦顯微鏡比傳統的熒光顯微鏡更容易漂白標本嗎?

  答:熒光標記標本的漂白是熒光顯微鏡的一個主要問題。與傳統的熒光顯微鏡將標本處于低能量和寬光束的激發光中相比,激光掃描共聚焦顯微鏡由于使用高能量和聚焦的光束,所以會增加標本的漂白。但是使用激光掃描共聚焦顯微鏡在采集圖像時,每次只照射標本上一個微小的區域, 并且照射時間很短,所以又減少了標本的漂白。

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  問:蔡司倒置和正置顯微鏡的不同物鏡的數值孔徑是什么?

  答:蔡司倒置和正置顯微鏡有15種不同的物鏡:

  Plan-NeoFluar 5X/0.15, D=0.17 mm, Ph1, WD=13.6 mm

  Plan-NeoFluar 10X/0.30, D=0.17 mm, DICI, WD=5.6 mm;

  Plan-NeoFluar 20X/0.50, D=0.17 mm, DICII, WD=2.0 mm;

  Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.2 mm;

  Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, Ph3, WD=0.2 mm

  Plan-Apochromat 63X/1.4 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.19 mm

  Plan-APO 20x/0.75 DICII

  Plan-APO 20x/0.60 Ph2

  Plan-APO 100xOil/1.4 DICIII

  Alpha Plan-Fluar 100X/1.45 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.11 mm

  C-Apochromat 63X/1.20 W CORR, D=0.14 to 0.18 mm, DICIII, WD=0.24 mm;

  Achroplan 10X/0.30 W Ph1, WD=3.1 mm;

  Achroplan 20X/0.50 W Ph2, WD=1.97 mm;

  Achroplan 40X/0.80 W IR DICIII, WD=3.61 mm;

  Achroplan 63X/0.90 W IR DICIII, WD=2.0 mm;

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  問:當我通過目鏡觀察時很難找到自己的標本時,有特別的技巧使我能更容易的找到標本嗎?

  答:請核對以下幾點:

  確定分光器被選擇在目鏡的位置上,并有光照射在標本上。

  如果使用的是汞燈,確定你選擇了正確的熒光濾片。

  確定標本的方向放置正確, 蓋玻片應該朝向物鏡。

  如果你使用的是油鏡,確定在物鏡和蓋玻片之間有足夠的油,并且沒有氣泡。

  一邊移動平臺一邊觀察,因為眼睛更容易看到移動的物體。

  如果你仍然看不到任何東西,很有可能就是你的標本沒有著色,你來雙光子實驗室之前應該首先用自己實驗室的熒光顯微鏡觀察自己的標本。

  也有一個可能就是汞燈的位置不正。這時不要嘗試自己去維修汞燈,而是請我們的工作人員去調節汞燈的位置。我們會確定是否只有這個問題,或者能找到別的原因使你找到標本。

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  問:為什么我的標本聚不上焦?

  答:顯微鏡的高倍鏡都有高的數值孔徑(達到1.4)和很短的工作距離(100–200 微米),所以標本必須靠近物鏡。最常見的問題如下:

  1. 蓋玻片厚度不合適,高倍鏡無法“穿透”蓋玻片到達標本。

  改進 – 使用 #1 或者 #1.5 蓋玻片。

  2.細胞種在載玻片上,使用封片劑封好,然后蓋上蓋玻片。如果使用了過多的封片劑,造成標本過厚,也可能使物鏡無法聚焦到標本。

  改進 - 用較少的封片劑,或者把細胞種在蓋玻片上,然后固定在載玻片上。

  3.如果細胞種在有墊圈的槽里,而在固定標本的時候墊圈未去掉,也會使得物鏡離標本太遠。

  改進 – 把墊圈去掉或者將細胞直接種在有蓋玻片底(取代載玻片底)的槽里。

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  雙光子熒光顯微鏡方法 


  問:什么是雙光子顯微鏡技術?

  答: 雙光子顯微鏡技術是建立在雙光子激發效應的基礎上的一種熒光激發技術:熒光染料分子可以同時吸收低能量的兩個光子而被激發(兩個光子到達熒光分子的時間間隔小于 1 飛秒),其激發效果可以等同于吸收一個 1/2 波長的高能量光子。

  雙光子的激發需要很高的光子密度。隨著離焦平面的距離越遠,光子密度程非線性迅速下,雙光子激發也幾率大大下降,因此只有近焦平面的染料分子才被激發,焦平面以外的組織不易發生光漂白和光毒性。雖然雙光子激光器發出的激光具有很高的峰值能量,但平均能量很低,只有十分之幾毫瓦,不足以引起標本的過熱。

  另外一種回答是:

  傳統的熒光顯微鏡的缺點是焦平面以外的信息也能被采集, 難以給細胞或組織內的蛋白精確地定位。 目前的解決辦法是使用激光掃描共聚焦顯微鏡或者寬場去卷積技術來獲得焦平面的信息。

  在這些系統給一些科研提供解決辦法的同時,還有兩個問題需要克服。一個就是生物體組織對光是高度散射的,厚標本的信息很難采集。另一個是熒光分子的激發一般對細胞都有毒性,一般在時間序列圖像采集的時侯,細胞的活性只能維持數分鐘。

  目前克服這些問題的技術是利用紅外超短脈沖激光器產生激光來雙光子激發標本。 激發同樣的熒光分子,雙光子的波長大約是單光子激發所需波長的兩倍。長波長的光子不易被細胞吸收,因此對活細胞的光毒性減少,也降低了光漂白。另外長波長的光比短波長的光受散射影響較小,容易穿透標本,能夠用來觀察更厚的標本。

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  問:雙光子激發的優點是什么?

  答:

  1.增加了染料的選擇性:共聚焦系統的激光器(Ar, Ar/Kr, HeNe)的激發光范圍在 488nm - 647nm 。這就意味著想用紫外激發熒光染料的實驗進行,例如使用 DAPI , Hoescht 。而雙光子的激發波長是單光子的兩倍,所以紫外激發的染料能被近紅外光激發。

  2.減少光漂白:因為光漂白減少的減少使得用 CFP/YFP 做熒光共振能量轉移( FRET )的實驗的成功率提高。

  3.無需特殊的物鏡:從硬件的角度出發,用近紅外光的波長激發紫外激發染料不需要特殊的紫外光學組件。

  4.提高信噪比:激發光波長和發射光波長具有很大的差別,提高了信噪比。

  5.漂白局限于焦點處:因為熒光激發只發生在物鏡的焦點上,所以就不需要共聚焦針孔了。這樣提高了光的檢測,而且光漂白只發生在焦點上。

  6.更容易穿透標本:紅外波長的光不易被細胞散射,能穿透更深的標本。

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  問:雙光子顯微鏡方法和激光掃描共聚焦顯微鏡方法有何不同?

  答:雙光子顯微鏡方法從很大程度上減少了普通的共聚焦顯微鏡方法存在的問題:

  1.激光能引起熒光物質的光漂白。 因為共聚焦顯微鏡的針孔阻擋了組織發射的大部分的光,其中包括一些來自焦平面的光。所以為了獲得足夠的信噪比,需要很強的激發光。而強激光連續的掃描,導致了熒光染料的漂白。因此在做斷層掃描或者時間序列掃描時,熒光信號逐漸變弱。

  2.光毒性也是一個問題。熒光染料分子的激發會產生毒性自由基,如果實驗者想保持標本活的狀態,必須限制掃描的時間和激光的強度。

  3.短波長的光被細胞成分散射不易穿透標本。

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    普通顯微鏡方法 


  問:我怎樣固定一個用于顯微鏡觀察的厚標本并且不損壞它?

  答:你需要將蓋玻片墊高,至少要達到標本/細胞的高度。有多種方法可用,例如:

  1.用膠布(透明膠,電工膠)在載玻片和蓋玻片之間做一個“步距”。

  2. 從膠布的中間剪出一塊小的面積作為標本池,將標本放入中間的池中,蓋上蓋玻片封好。

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  問:我能固定 GFP 標記的標本嗎?

  答:GFP 的熒光會經脫水或者乙醇和丙酮固定而衰減,這些固定方法可能改變了 GFP 分子的性狀。有研究報道,GFP 經甲醛固定后,熒光信號會大大減弱;標本長期放置在乙醇中會消弱 GFP 信號,并增強自發熒光。但是也有其他研究報道,用多聚甲醛(4% 緩沖液,固定 1 小時)可以成功地固定了轉 GFP 的酵母細胞,熒光信號沒有減弱。因此,你可以用低濃度的多聚甲醛,盡可能短時期地固定(對于細胞約 5~10 分鐘)。標本可以放在甘油封片劑中(約含 90% 的甘油)。

  注意:如果你的 GFP 是可溶性蛋白,會因為去垢劑的破膜丟失所有的信號。

  據報道用指甲油封片可以導致 GFP 信號的丟失(因為指甲油中的乙酸乙酯/丙酮成分)。有報道以下方法可以用于封片:a) Almay Crème(hypo-allergenic,"Canyon" shade); Wet 'n Wild's " Clear Nail Protector " 不含甲苯/甲醛(固定在苯二胺的甘油溶液中); b) 融化的石蠟:簡單的辦法就是將石蠟加熱融化用作封片劑。

  使用活體組織和活細胞采集GFP信號, 可以獲得最好的圖像。

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  問:抗熒光淬滅劑的作用是什么?

  答:當熒光染料暴露在激發光下時,幾乎都有漂白的現象(光漂白)。光漂白和以下因素有關:1)照射光的強度;2)照射光的照射時間; 3)其他影響熒光強度和熒光漂白的因素有pH、培養介質的性質,其他熒光淬滅的物質存在。

  一種染料的光子產量代表染料被完全光漂白之前的激發周期的平均次數。平均光子產量是熒光量子效率(Qf)和漂白量子效率(Qb)的比。例如:熒光素對光很不穩定,在堿性溶液中 Qf /Qb 大約為 30K。Qf 和 Qb 都屬于染料的性質,受染料環境的影響很大。主要影響 Qb 的因素是活性氧和自由基類物質。

  一種抗熒光淬滅劑的主要目的是保持染料的熒光,使標本能用于更長時間的觀察。抗熒光淬滅劑通常是通過抑制活性氧的產生和擴散來達到這一作用,因此降低了Qb,Qf并沒有伴隨著降低,熒光仍然保持不變。

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  問:推薦使用哪些抗熒光淬滅劑?

  答:一些常用的和最有效的抗熒光淬滅劑的優缺點比較如下,也提供了部分的商業來源以及共聚焦顯微鏡用戶的意見和評價。

  1.p-phenylenediamine (PPD)

  盡管它是最有效的抗淬滅劑之一,但對光和熱都有較強的敏感性,而且具有毒性,后者也限制了在體內研究的應用。Krenik 等(1989)建議最理想的 PPD 抗淬滅劑混合液配方是:90% 甘油、10% PBS,其中 PPD 的濃度在(2~7)mM 之間,最終pH值為 8.5~9.0。

  2.n-propyl gallate (NPG)

  NPG 無毒性,對光和熱穩定,但抗漂白效果不如 PPD,可用于體內研究。推薦濃度在(3~9)mM,用甘油配置效果也不錯。配置的方法在FAQ的后部分。

  3. 1,4-diazobicyclo[2,2,2]-octane (DABCO)

  DABCO是一種不電離的、穩定的抗淬滅劑,價格便宜而且容易使用。配置方法在 FAQ 的后部分。

  4.Ascorbic acid (Vitamin C)

  5.Vectashield

  公司描述:具有在顯微鏡觀察中阻止熒光的丟失并在長期儲存過程中保持抗熒光淬滅的能力。抑制熒光素的漂白,例如:Texas Red , Rhodamine , AMCA 和其他的熒光染料。特別的是,比甘油緩沖液、聚乙烯醇固定液或者其他含有普通抗熒光淬滅劑的固定液更加穩定,光學清晰度更高。

      Vector Laboratories, Inc.

      30 Ingold Road,

      Burlingame, CA 94010 USA

      Tel: (415) 697-3600

      Fax: (415) 697-0339

  6.SlowFade

  公司描述:SlowFade 的原始配方(S-2828)可將熒光素的熒光淬滅速率減小到零。尤其適用于激光掃描共聚焦顯微鏡的定量測定,因為其在測定時往往要求激發光強度較強,而且采集時間也較長。SlowFade 試劑可使熒光素的有效熒光發射擴大 50 倍以上,用該試劑封片后,細胞和組織中的熒光信號可保持兩年之久。原始的 SlowFade 配方實際上可使熒光素的熒光完全淬滅,也可使 Cascade Blue 和 Alexa Fluor 350 熒光團的熒光幾乎完全淬滅。

      Molecular Probes, Inc.

      P.O. Box 22010 Eugene, OR 97402-0414 USA

      Tel: (503) 465-8300

      FAX: (503) 344-6504

  7.SlowFade Light

  為了克服上述的局限,分子探針公司的研究人員又研制了 SlowFade Light 抗熒光淬滅試劑盒。該抗熒光淬滅劑的配方使熒光素的淬滅速率降低 5 倍,而熒光素的初始熒光強度沒有顯著降低,因此使光學顯微鏡的信噪比顯著提高。此外,對 Cascade Blue, Alexa Fluor 350, tetramethylrhodamine 和 Texas Red 的淬滅也達到最小。實際上,SlowFade Light 抗熒光淬滅劑試劑盒可將 Cascade Blue 的淬滅速率幾乎降到零,而其發射強度僅降低約 30%。

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  問:DABCO抗熒光淬滅封片劑的配方是什么?

  答:DABCO 儲藏液

  1.在 60℃ 下,溶解 2 克 DABCO(抗熒光淬滅劑)于 90ml 甘油中,15-30 分鐘。

  2.加 10 ml 1M Tris-HCl,pH 7.5

  3.用 5M HCl 調節 pH 值到 8.0

  4.冷卻到室溫

  5.加 100 ml 20% thimerosal(溶解于水)

  6.可選:加 50 ml PI (儲液:溶于水的 1 mg/ml PI )

  7.4℃ 于棕色瓶或箔紙包裹的瓶子中避光保存

  縮寫:

      PI = propidium iodide

      PI – 激發光與發射光與羅丹明相似 – 用 488 nm 或者 514 nm 的激發光 – 長通 570 nm 或者 600 nm 的發射濾片

      DABCO = 1,4-二偶氮雙環[2,2,2]-辛烷

      Ordering (Sigma) :

      D2522 DABCO, 25g

      T5125 thimerosal, 10g

      P4170 PI, 10mg

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  問:N -丙基沒食子酸鹽(n-propyl gallate ,NPG)抗熒光淬滅封片劑的配方是什么?

  答:

      溶于甘油的 5%N -丙基沒食子酸鹽

      1.于 50 ml 試管中,加 5% N -丙基沒食子酸鹽到 25 ml 甘油中

      2.搖晃混合過夜(室溫或者 4℃)

      3.使用之前靜置一天,讓溶液中的氣泡跑掉

      4.4℃ 于棕色瓶或箔紙包裹的瓶子中避光保存

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  問:采集的信號很弱,我該怎么辦?

  答:決定圖像質量的最重要的因素是標本質量。好的染色過程可以使圖像具有強的信號和完全黑的背景。以下列舉了部分的方法用來檢測你的染色是否是最佳的:

  廠商在他們的指南中經常會有“最佳稀釋法”,你不能相信這個方法適合于所有的標本制備的方法。最好的辦法是對一抗和二抗做一個梯度稀釋,測定哪個稀釋濃度處理的標本信號最好,背景最低。

  盡量調整好阻斷的步驟(改變阻斷溶液的成分和洗脫時間)。如果樣品要用甲醛固定,請確定不含游離的乙醛。有些調整是硬件方面的(光強或者檢測的靈敏度),在信號很弱的標本上做硬件的調整,經常會導致背景很高。

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